對于從事分子生物學的研究的實驗室來說，質粒抽提幾乎是每天都用做的常規技術。最近，杭州新景生物技術部常收到來自童鞋們的各種求助，像質粒提取失敗了、不是自已想要的那個質粒及提取得率低等等。

 哈哈~關于這些問題，小編覺得呢，其實提取質粒并不難，基本上按照質粒提取試劑盒的說明書，小心操作，一般不會有問題。但是為什么還會有這些問題存在？因為在實驗中我們應該注意一些我們經常忽略的細節?？赡軐嶒炇业沫h境的污染，操作時的不注意都會造成我們培養細菌時染雜菌，使得在質粒的提取過程中現象出現異常，導致實驗不成功。說到這里，有些童鞋可能會問：那我們染的雜菌是什么菌呢？其實大部分為真菌，也有可能是革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌等。

為了讓大家能能判斷出所用的菌體是否染雜菌，繼而能從實驗現象可以判斷出該原因，小編特意在本實驗室里做了一個從染雜菌的細菌中提取質粒的對照模擬實驗。

實驗方案

實驗步驟

根據simgen快速質粒DNA小量試劑盒的說明書的操作步驟進行實驗。

實驗結果

（一）  Buffer II裂解不完全

如上圖所示1、2號為正常的大腸桿菌加入BufferII后溶液變粘稠的澄清液體；而部分染菌的細菌3、4號變為粘稠的渾濁液體；全為雜菌的5、6號加入之后溶液呈不粘稠的渾濁液體。

 在加入Buffer II時，其中的堿性溶液能使革蘭氏陰性菌的細胞壁破裂以及蛋白質變性，從而釋放出質粒DNA、基因組DNA等細胞內容物。對于1、2號正常的革蘭氏陰性細菌，Buffer II溶液能將其細胞壁破裂，釋放出質粒DNA等細胞內容物從而溶液變為粘稠的澄清液體，而3、4號，我們可以看到它出現了粘稠的渾濁液體，這是因為Buffer II溶液能溶解正常的革蘭氏陰性細菌的細胞但部分雜菌（革蘭氏陽性菌、真菌）的細胞壁卻不能破裂，不能被破裂的雜菌呈現渾濁狀。5、6號都為雜菌，它們的細胞壁較厚，Buffer II溶液只能裂解很小部分的細胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），細胞內的基因組DNA等其他細胞內容物難以釋放，所以它呈現了不粘稠的渾濁狀。

（二）拷貝數降低或質粒丟失

圖2

如上圖所示1、2號正常細菌濃度平均在545ng/μl左右，而3、4號染雜菌的細菌濃度平均在340ng/μl左右，較1、2號正常的細菌濃度有明顯的降低，這是因為雜菌不含質粒DNA，故相同細菌量時，所得的質粒DNA就減少了；而全部為雜菌的5、6號則濃度最低，平均為83ng/μl?？吹竭@里同學們可能就有疑問了那為什么雜菌也會有濃度呢？這是因為Buffer II溶液對雜菌的細胞壁仍有腐蝕作用，但是只能溶解部分的細胞壁使其穿孔而泄露部分核酸（主要是RNA），而濃度值主要是因為有RNA殘留。

在我們平時轉接菌液時，很多同學或實驗室人員為了方便會多次轉接我們要用的菌液。其實這是個嚴重的不規范操作行為，會很容易造成雜菌污染，因為每次開蓋轉接都會存在染雜菌的風險，多次開蓋會使染雜菌的風險增大，一旦染雜菌后就會對這次以及以后的實驗會產生影響，即在一次次的轉接時雜菌長時間在培養液中，大量傳代，以至于它們在培養液中的比重加大，造成在隨后的質粒抽提等的實驗中影響實驗結果，會產生最后所提的質粒得率降低等問題。

 （三）  從電泳圖的亮暗來判斷

圖3

如上圖所示1、2號正常細菌條帶亮于染雜菌的3、4號細菌，而全為雜菌的5、6號則看不到條帶，因為它不含質粒。

看到這里童鞋們可能會問那怎么避免細菌培養中長雜菌呢，那就需要童鞋們在實驗的過程中注意細節，保證在無菌環境下操作且用到的東西都事先滅菌；控制細菌過夜培養時間；每次接種細菌都從新鮮制備或劃線的平板中挑取單菌落接種；并且在質粒抽提前仔細閱讀試劑盒說明書后進行操作；注意這些細節小編相信實驗一定會成功的~

好了，今天就說到這里了，小編下次繼續和大家聊“質粒的那些事兒”，同時大家可以關注新景生物實驗室（極簡生物），定期有驚喜哦~請留意更新哦！

                                                                                                                                                                                    杭州新景生物實驗室

                                                                                                                                                                                           2016年1月11日